紫外可見分光光度計都有一個根據使用需要而設計的光度室(又叫樣品室)。光度室是使用者直接操作的地方。從單色器出來的單色光，一般是通過一個小透鏡射到比色皿上，比色皿中的試樣對單色光吸收一部分，透過一部分。其透過部分射到光電接收器上轉變成電信號，再通過電子系統進行放大、處理，然后打印輸出。
光度室一般由光度室蓋、聚光透鏡、比色皿、比色皿架、石英窗片等組成。
1.光度室蓋。光度室要求嚴防漏光，這取決于光度室蓋。許多儀器制造商和使用者，往往不注意這個問題。有的儀器在光度室蓋門的地方不密封，或者實驗室房間的白光可進入光度室系統，所以測試結果因雜散光增大而導致誤差增大。因此，光度室蓋門的密封性很重要。使用者應經常檢查光度室的密封性，嚴格做到光度室系統不漏光，以減少雜散光，保證分析測試結果的可靠性。
2.聚光透鏡。聚光透鏡將從單色器射出的發散光變成平行光(有些儀器為聚光，但不符合比耳定律)，再射到比色皿上。如果射到樣品上，則要求單色器的出射狹縫處在聚光透鏡的焦點上。聚光透鏡要求消色差，否則不同波長的光不能聚在比色皿的中心。但有些普及型的紫外可見分光光度計儀器也有不用聚透鏡的。有些要求不高的儀器為加強聚光能力，聚光透鏡只是把從單色器射出的發散光直接聚在比色皿。
3.比色皿。比色皿又稱吸收池或樣品池，是光度室的關鍵部件。我們在分析測試時，一般是同時利用兩個分別盛有參比溶液和被測樣品溶液的比色皿，對它們進行分別測試(雙光束儀器同時測試)，比較測試的吸光度(或透射比，一般都是比較吸光度)。因此，為了建立準確比較的基礎，對比色皿的大小、形狀及比色皿的兩塊透光面的平行度、光路長度、光譜特性等都應該進行匹配(配對)。即使是同一批次的同一規格的比色皿，其光路長度也不可能兔全相等，透光面的透光特性、幾何尺寸、平行度等都可能有差異，因此需要挑選配對使用。
比色皿幾何尺寸的誤差會給測試結果帶來很大的誤差。由比色皿引起的分析誤差可以根據比耳定律計算出來。
應該注意的一個重要問題是，在相對測量法中，如果隨意調換參比比色皿與樣品比色皿，比色皿的光程誤差與配套誤差是不可忽視的。特別是比色皿的配套誤差，更應引起使用者的高度重視。
